第3题
①PCR扩增。优点:简便快速,高效,数kb单基因克隆。缺点:DNA聚合酶活性和保真性限制。(94℃变性→55℃退火→72℃延伸→94℃变性……)
②文库筛选。优点:长片段,无碱基错误,位置序列基因克隆。缺点:繁琐,过程复杂,耗时,昂贵。
③化学合成:简便,准确,已知序列基因克隆,引物合成。缺点:受合成仪性能限制,长度很短。
第4题
有人建议用PCR扩增同该蛋白质结合的微量DNA,思路是(图Q25.8):①合成一组长为26个碱基的随机序列的寡聚核苷酸混合体,在该序列的两侧各有一段25个碱基的序列作为PCR扩增的引物位点[图Q25.8(a)];②把这些寡聚核苷酸加到含有转录因子的细胞粗提取物中,转录因子可以同含有结合位点的寡聚核苷酸结合;③用转录因子特异的抗体分离同转录因子结合的寡聚核苷酸;④用PCR扩增选择到的寡聚核苷酸进行序列分析。
图Q25.8 用随机的寡聚核苷酸选择和扩增特异的DNA序列(a)用于选择的原初随机序列的寡聚核苷酸,N代表任何一种核苷酸;EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点有利于选择DNA的克隆和序列分析。(b)同序列特异的DNA结合蛋白结合的寡聚核苷酸的选择和序列分析方案按照这一思路,用0.2ng单链随机序列的寡聚核苷酸开始了这项实验,这个寡聚核苷酸可以同一个PCR引物结合成部分双链,经过如图Q25.8(b)所示的四轮选择和复制后,用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ消化分离到的DNA,将片段克隆到质粒中,并测定了10个独立的克隆(表Q25.1),问:
表Q25.1 10个克隆的序列
注:画线的序列是PCR引物部位,两种序列都是从BamH Ⅰ末端开始,所有序列中结合位点的方向都是相同的。
第5题
A.NA连接酶能将2个末端互补的DNA片段连接在一起
B.逆转录酶是以核糖核苷酸为原料,以RNA为模板合成互补DNA
C.限制性内切酶可识别一段特殊的核苷酸序列,并在特定位点切割
D.限制酶不能切割烟草花叶病毒的核酸
第6题
因子通常已经失活。你可以想出一个极好的方法以加快分析速度。你可以合成一段不含胞嘧啶核苷酸的DNA序列,将这段序列放到启动子后在一适当反应混合物中温育,这个启动子将指导不含鸟嘌呤核苷酸的转录本的合成,如果不加GTP,只产生一定长度的RNA转录本,这个RNA转录本来自于合成的DNA序列。因为其他转录本都在需G处被终止。如果你能使这个想法得到实现,则快速分析特殊序列的转录仅通过测量标记核苷酸的放射性就可实现。
为了验证你的想法,你构建两个携带合成DNA的质粒。一个具有腺病毒的启动子(PmL1),另一个无启动子(PC1)。把两种质粒同纯化的RNApolⅡ、纯化好的转录因子样品及32P-CTP混合,除此之外,再加入各种组合的GTP、RNaseT1(可以切开RNA与G的连接)和3'-氧甲基GTP(无论何时它参入正在形成的链,它就会终止转录),通过凝胶电泳测定结果如图13-3-42所示。
第8题
A.用限制酶消化DNA。
B.把DNA连接入一个载体。
C.在胶上分离DNA片段
D.把DNA片段转移到硝酸纤维素膜上。
E.膜与标记的探针杂交。
第9题
你纯化了与这种效应有关的蛋白,显示它使非缺失的模板及-61缺失的模板转录都增强了10倍,面对-50缺失的模板无激活作用,印迹分析表明这个因子同一个TATA位点上游的特殊的短序列相结合,虽然这种因子在TFⅡD缺乏时同它的结合位点的结合是短暂的,但当TFⅡD存在时,它可与结合位点稳定地结合。
第10题
如果DNA碱基序列为5pCpApGpTpTpApGpC—OH3,下列哪一片段是其互补序列?()
A.5"pGpTpCpApApTpCpG—OH3" 、
B.5"pGpCpTpApApCpTpG—OH3"
C.5"OH—GpCpTpApApCpTpGp3"
D.5"OH—GpTpCpApApTpCpGp3"