用EcoRI酶消化T7DNA，所有片段都能环化吗？

质粒pHUBI DNA是双链环状，长5.7kb(5.7×10³个碱基对)。这个质粒带有某基因，它的蛋白质产物使宿主细菌对四环素具有抗性(Tet-r)。该DNA对下列每种限制酶具有一个识别位点：EcoRI、HpaI、BamHI、PstI、SalI、BglII。在BarnHI和SalI位点处克隆会破环四环素抗性；在其他酶的位点处克隆则保留四环素抗性。用各种限制酶以及酶混合物消化可得到如表16-2-11所列的DNA片段。试在pHUBIDNA图上标出所有这些酶的切点。将DNA图画成环形，在圆周上以5.7kb总长标出刻度。

表16-2-11
酶混合物	片段长度(kb)
EcoRI EcoRI，BamHI EcoRI，HpaI EcoRI，SalI EcoRI，BglII EcoRI，PstI PstI，BglII BglII，HpaI	5.7 0.4，5.3 0.5，5.2 0.7，5.0 1.1，4.6 2.4，3.3 1.3，4.4 0.6，5.1

段插入质粒pBR322，转化到A基因缺失的大肠杆菌突变体中，并找一种需要A基因活性的选择标记。对基因B的实验是，用反转录酶合成袋鼠肝细胞mRNA，已知肝细胞含有可合成大量酶B的DNA拷贝。然后将这些DNA拷贝插入pBR322，转化到不能合成有功能B酶的大肠杆菌突变体中，将B活性作为选择标记。

A.用限制酶消化DNA。

B.把DNA连接入一个载体。

C.在胶上分离DNA片段

D.把DNA片段转移到硝酸纤维素膜上。

E.膜与标记的探针杂交。

用EcoRI酶解具有单个EcoRI位点的Tet-r质粒。将样品退火，用DNA连接酶处理，然后进行CaCl₂转化实验。挑选Tet-r菌落。从这些菌落中分离出质粒DNA，进行凝胶电泳，结果发现有两类菌落：一类菌落在原来质粒的预期位置处出现一条带；另一类菌落则得到一条移动慢得多的带。这条移动慢的带可能是何物？(用BglI酶处理Kan-rAmp-r质粒会破坏amp基因)

果蝇中P因子的转座酶由4个外显子(0，1，2，3)编码。此基因在生殖细胞中的转录产物长度为2．1 kb，包含所有这4个外显子，并编码具有转座酶活性的蛋白质。体细胞中P因子的转录产物长度为2．5 kb，除了含有全部的4个外显子之外，位于外显子2和3之间的内含子也被保留下来。 (1)体细胞中产生的较长的mRNA编码的蛋白质的大小只相当于在生殖细胞中产生的较短的转录产物编码的蛋白质的75％。较长的转录产物为什么会编码较小的蛋白质产物？ (2)反转录酶能够用来从mRNA合成得到相应的双链DNA，这个DNA拷贝称为cDNA。如何利用cDNA和转基因技术得到在体细胞中也有转座酶活性的果蝇？ (3)假设用限制酶SaZ工消化P因子后得到8个片段。用来自果蝇生殖细胞的转座酶的cDNA作为探针对它们进行Southern杂交，结果发现所有的8个限制酶切片段都显示阳性条带。上述结果说明了什么？

四膜虫(Tetrahymena)是一种有两个胞核的有纤毛原生动物，小胞核(micronucleus)具有细胞染色体的主拷贝，其参与有性接合，但不参与日常基因的表达。大胞核(macronucleus)是一种由很多大小基因双链DNA片段形成的细胞基因组的“工作”拷贝(小染色体-minichromosomes)，其参与基因转录，小染色体的许多拷贝中都有核糖体RNA的基因。可用梯度离心将其与其他小染色体分离，以进行进一步的研究。

通过电镜检测发现每个含核糖体基因小染色体为线性结构，长21kb。用琼脂糖凝胶电泳观察其仍为21kb(图16-3-24，泳道1)。如果用限制酶BglⅡ酶切小染色体，产生的两个片段13.4和3.8kb加起来不到21kb(图16-3-24，泳道2)。用其他限制酶酶切DNA，所得片段大小加起来仍旧不足21kb，而且每一种消化所产生的片段大小之和均不同。

如果未切割的小染色体在跑电泳之前先经过变性退火，那么21kb片段将被切割成正好是其一半的10.5kb。用双链片段代替(图16-3-24，泳道3)，相似地，如果BglⅡ切割过的小染色体经变性和退火，则13.4kb片段将被其一半大小的6.7kb双链片段代替(图16-3-24，泳道4)。

请解释为什么限制酶切割下的片段加起来不是21kb？为什么经变性退火后其电泳形式就发生改变？你认为核糖体小染色体的序列是什么样的？

从原位杂交结果知道，5个含有基因组片段的YAC(A～E)杂交到人类基因组某染色体的一条特异的带上。基因组DNA被切点稀有的限制性内切酶消化后的产物分别与5个放射性标记的YAC杂交，放射自显影结果如下：

(1)3条限制性酶切条带的顺序如何？ (2)分别给出5个YAC与3个酶切片段的相对位置。

用一种限制性内切核酸酶消化某大型的环状质粒DNA。得到的片段随机重装配(即片段不再按原来顺序排列)，选择与原来质粒分子量相同的环状分子。然后用由这些片段组成的分子感染不含质粒的宿主细胞。